EHA101感受态细胞

保存条件：-80℃。

1.产品简介：

基因型C58 (rif R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA)(kanR,strepR)Nopaline

EHA101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pEHA101(pTiBo542DT-DNA) 型Ti质粒含有筛选标签：strep、kan，赋予EHA101菌株链霉素抗性和卡那霉素抗性，适用于玉米、水稻、烟草等植物的转基因操作，经pK7WGF2质粒检测转化效率可达104 cfu/μg DNA。

2.使用说明：

1).取-80℃保存的农杆菌感受态于冰上待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

2).每100 μl感受态加1 μg（体积不大于10μl）质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。

3).加入700 μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃，200rpm振荡培养2~3小时。

4).6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。（当平板只含有转化所用双元载体抗生素时，28℃培养48小时即可；平板中同时加入双元载体抗生素，20μg/ml rif 时，需28℃培养60小时；如果使用的平板含有50μg/ml rif 则需要28℃培养72-90小时）。

3.注意事项：

1).加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

2).混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3).利福平浓度不应高于25 μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板同时含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2。

4).培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。

*本试剂仅供实验室研究使用